Diseño y evaluación de prototipos bioinsecticidas para el control de la mosca del olivo

Publicado en Revista de Fruticultura nº73

RESUMEN

La mosca del olivo, Bactrocera oleae, es un problema grave para los olivos a nivel mundial. A pesar de su importancia económica, existe un limitado número de productos autorizados para su control, siendo en su mayoría sustancias químicas. Además, el uso continuado de productos fitosanitarios convencionales genera un impacto negativo en el medio ambiente y en las personas, a la vez que incrementa la aparición de resistencias.

En el presente artículo se describen los primeros resultados de una línea de investigación dentro del Proyecto Innolivar cuyo objetivo es la “Elaboración de un formulado pre–comercial de hongos entomopatógenos para el control de la mosca del olivo”.

En este trabajo se determinaron las propiedades biológicas de Metarhizium brunneum cepa EAMb 09/01–Su, se diseñaron 8 prototipos bioinsecticidas y se evaluaron ex vivo sobre el tetrífido modelo Ceratiitis capitata. Las formulaciones WP–B y OD–G mostraron niveles de eficacia prometedores sobre larvas (80–93%) y pupas (64–68%).

Palabras clave: Bioinsecticida, Hongo entomopatógeno, Mosca de la fruta, Ceratitis capitata, Mosca del olivo, Bractocera oleae.

ABSTRACT

Design and evaluation of bioinsecticide prototypes for the control of the olive fly. The olive fly, Bactrocera oleae, has been a serious problem for olive trees worldwide. Despite its economic importance, there are a limited number of products authorized for its control, mostly chemical substances. In addition, the continued use of conventional phytosanitary products generates a negative impact on the environment and on human health, while increasing the appearance of resistance.

This article addresses the first results of a line of research within the Innolivar Project with the objective of “Preparation of a pre–commercial formulation of entomopathogenic fungi for the control of the olive fly”.

Research describes the biological properties of the Metarhizium brunneum strain EAMb 09/01, the design of eight formulation prototypes, as well as the results of ex vivo efficacy tests using the tephritid model Ceratitis capitata. The WP–B and OD–G formulations showed promising control levels over larvae (80–93%) and pupae (64–68%).

Key words: Bioinsecticide, Entomopathogenic fungus, Fruit fly, Ceratitis capitata, Olive fly, Bractocera oleae.

Una de las principales plagas del olivar es el insecto tetrífido conocido como “la mosca del olivo” (Bactrocera oleae), la cual afecta negativamente tanto a la producción (por caída de frutos) como a la calidad del aceite, siendo éste un problema generalizado en toda la zona mediterránea y en otras áreas productoras de aceite en el mundo. En España existen diferentes programas para su manejo y control. Así dentro del Programa de Mejora de la Calidad de la Producción de Aceite de Oliva y de Aceitunas de Mesa, desde 1990 se viene desarrollado un subprograma específicamente dirigido al control de esta plaga. El sistema consiste en acciones de alerta integrados en una red (RED DACUS) que genera una serie de datos en base a los cuales se diseñan los tratamientos fitosanitarios que consisten en pulverizaciones aéreas y/o terrestres de productos químicos y en el uso de “Tecnologías de Control Biológico” en zonas ecológicamente sensibles. El subprograma incluye además acciones piloto para la racionalización de tratamientos integrados del olivar, cuyos resultados se transfieren a los productores (fuente: https://www.mapa.gob.es/es/alimentacion/planes-y-estrategias/mosca1.aspx). Además, el ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente publicó en 2014 la “Guía de Gestión Integrada de Plagas del Olivar” (NIPO: 280–14–180–1 (línea) DEPÓSITO LEGAL: M–28809–2014), dentro del Plan de Acción Nacional para el uso sostenible de productos fitosanitarios de acuerdo con lo establecido en el Reglamento Europeo 1107/2009 y la directiva 2009/128/CE, que tiene como objetivo reducir los riesgos y efectos del uso de plaguicidas en la salud humana y el medio ambiente y fomentar la gestión integrada de plagas, incluyendo las alternativas no químicas a los plaguicidas.

A pesar del esfuerzo realizado durante todos estos años, “la mosca del olivo” representa todavía el principal problema fitosanitario en la producción de aceituna en la zona mediterránea. Para el control de esta plaga en España, están autorizadas actualmente ocho materias activas de síntesis (acetamiprid, cipermetrin, deltametrin, dimetoato, fosmet, imidacloprid, y lamda cihalotrin), que se aplican por pulverización al suelo o follaje o bien mezcladas con un cebo en trampas; dos coadjuvantes de insecticidas (urea y proteínas hidrolizadas), que se usan como atrayentes en trampeo, y tan solo una materia activa de origen biológico basada en el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana.

Aunque existen distintas herramientas autorizadas para el control de la “mosca del olivo”, el 62,5% de las formulaciones están basadas en sólo dos de las sustancias activas (deltametrin y dimetoato, esta última se prohibirá su uso a partir de julio del 2020). Es posible que el uso reiterado de estos productos haya generado la aparición de resistencias cada vez más documentadas a varias de las sustancias activas disponibles. Además, estas sustancias activas han sido o están seriamente cuestionadas por su impacto negativo sobre el medio ambiente y especies no objetivo (como abejas, peces, aves, etc.). Consecuentemente, hay una creciente alarma a nivel global por la dependencia de medios químicos para su control, por lo que se están desarrollando medios alternativos, que incluyen el uso de agentes de control biológico microbiano (Yousef et al., 2013, 2015, 2017 y 2018; García–Jurado et al., 2011; Konstantopoulou y Mazomenos, 2005; Benuzzi et al., 2007; Mahmud, 2009), nematodos entomopatógenos (Torrini, et al., 2017) sistemas de trampeo masivo con atrayentes y sustancias insecticidas en su interior (Altolaguirre–Obrero et al., 2003), artrópodos benéficos (Johnson et al., 2012; García–Jurado et al., 2011a), liberación de adultos estériles (Ahmadi, et al., 2018) o modificados genéticamente (Marubbi et al., 2017). También se han utilizado sustancias repelentes o inhibidoras de la oviposición como caolin o hidróxido de cobre (Caleca y Rizzo, 2007).

En el caso concreto de los bioinsecticidas, su desarrollo a partir de hongos entomopatógenos ha tenido un gran incremento en las últimas dos décadas, no solamente por su capacidad de control de diferentes insectos plaga sino por la seguridad para la población y el medio ambiente derivada de su uso, así como por la disponibilidad actual de sistemas de producción a escala industrial (Ravensberg, 2011). La mayor parte de los desarrollos se han llevado a cabo sobre un selecto grupo de hongos Hypocreales, particularmente sobre los géneros Aschersonia, Beauveria, Metarhizium, Isaria (Paecilomyces) y Lecanicillium (Verticillium) (Ravensberg, 2011). De entre todas estas especies, las más ampliamente estudiadas son Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, siendo estas las sustancias activas de la mayoría de bioinsecticidas presentes en el mercado, sin tener en cuenta los basados en la bacteria Bacillus thuringiensis.

Sin embargo, a pesar del incremento del uso de hongos entomopatógenos para el control de insectos plaga en agricultura, su uso contra tefrítidos es relativamente reciente. En la literatura científica, están publicados diferentes trabajos sobre la “mosca de la fruta” Ceratitis capitata (Ekesi et al., 2005, 2007; García–Jurado et al., 2011b, 2011c; Quesada–Moraga 2006, 2008), mientras que sobre la “mosca del olivo” Bactrocera oleae se han reportado usos experimentales de B. bassiana y B. brongniartii (Konstantopoulou y Mazomenos, 2005), ensayos de eficacia con un formulado comercial de B. bassiana (Benuzzi et al., 2007), bioensayos de laboratorio con formulaciones de B. bassiana, M. anisopliae y L. lecanii (Mahmoud, 2009), y ensayos experimentales y de campo con el hongo entomopatógeno Metarhizium brunneum (Yousef et al., 2013, 2015, 2017 y 2018).

En España hay seis formulaciones autorizadas bioinsecticidas basadas en hongos entomopatógenos, pero entre estos, solamente NATURALIS–L® (B. bassiana cepa ATCC74040), está expresamente autorizado para el control de la mosca del olivo. La escasez de medios de defensa fitosanitaria de origen biológico para el control de esta plaga, debidamente autorizados, produce la reiteración de tratamientos con productos basados en sustancias sintéticas que incrementan el desarrollo de resistencia de la plaga y el impacto negativo sobre el medio ambiente.

En 2019 se formalizó un contrato de compra pública de innovación en su modalidad pre–comercial como parte del Proyecto INNOLIVAR, entre la empresa agro–biotecnológica FUTURECO BIOSCIENCE, S.A. y la Universidad de Córdoba (UCO), de acuerdo con lo establecido en el Convenio entre el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad y la UCO, cofinanciado con fondos FEDER. El objeto del mencionado contrato es la “Elaboración de un formulado pre–comercial de hongos entomopatógenos para el control de la mosca del olivo”. FUTURECO BIOSCIENCE resultó adjudicataria en el proceso de licitación. El proyecto iniciado en febrero del 2019 concluirá en octubre del 2021.

Investigadores del Departamento de I+D de Futureco Bioscience desarrollarán y evaluarán un bioinsecticida pre–comercial como objeto de la licitación basado en el hongo entomopatógeno Metarhizium brunneum cepa EAMb 09/01–Su, proveniente de la colección de microorganismos de la UCO. La ejecución del proyecto se basa en un diseño conceptual del bioinsecticida abordado con un enfoque holístico que tiene en cuenta todas las características y condicionantes para que el formulado desarrollado sea factible desde un punto de vista técnico, económico y reglamentario. Para ello el proyecto incluye diferentes hitos que contemplan las siguientes actividades:

Caracterización microbiológica de la cepa de M. brunneum y determinación de los posibles metabolitos producidos por el hongo.

Secuenciación del genoma y búsqueda de marcadores moleculares específicos de la cepa para el estudio de su persistencia en condiciones de campo.

Producción de ingrediente activo a partir de la cepa EAMb 09/01–Su de M. brunneum en forma de conidios o microesclerocios y la formulación de diferentes prototipos (polvos mojables o suspensiones oleosas) a partir de conidios o bien formulaciones basadas en microsclerocios.

Evaluación de la eficacia de los prototipos formulados sobre la mosca del olivo, a nivel de laboratorio, semi–campo y campo.

En el presente artículo se describen los primeros resultados del proyecto, que incluyen la caracterización microbiológica de la cepa, la selección del sustrato más adecuado para la producción de conidios, la formulación de distintos prototipos formulados y la evaluación de su eficacia sobre el insecto modelo Ceratitis capitata en condiciones de laboratorio.

Caracterización de la cepa a nivel microbiológico

Como paso previo a la evaluación y selección de medios de cultivo y sistemas de fermentación, es necesario conocer lo más profundamente posible las propiedades biológicas del hongo relacionadas con su capacidad de reproducción. Para ello se investigó la capacidad de crecer de la cepa EAMb 09/01–Su en diferentes rangos de temperatura, pH, salinidad y actividad de agua y se determinó su actividad enzimática.

La cepa EAMb 09/01–Su presenta micelio septado que produce conidióforos los cuales generan cadenas de conidios de 5,13±0,44 µm (Figura 1A). Tanto en cultivo sólido (SDA) como en cultivo líquido (PDB), la cepa mostró actividad fosfatasa alcalina, esterasa (C4), fosfatasa ácida y N–acetil–Beta–glucosaminidasa. Las enzimas esterasa lipasa, leucina arilamidasa, naftol–AS–BI–fosfohidrolasa y b–glucosidasa solo se expresaron en el cultivo sólido SDA (Figura 1B). Estos estudios de evaluación de la actividad enzimática indicaron que la cepa produce, además de enzimas relacionadas con la absorción de nutrientes, enzimas que participan en la descomposición de la quitina y la cutícula de los insectos, estando implicadas, pues, en el modo de acción de la cepa.

En cuanto a la actividad de agua (Aw), la cepa EAMb 09/01–Su tiene un rango de crecimiento del 0% al 10% de PEG–6000 (Figura 1C); por lo tanto, se trata de un organismo osmotolerante ya que puede crecer con una baja actividad del agua. Por otra parte, es una cepa mesófila y acido–neutrófila, ya que el rango de temperatura de crecimiento está entre 20ºC y 30ºC y el pH oscila entre 3,24 a 8,48 (Figura 1D y 1E). Finalmente, respecto a la resistencia a la salinidad del medio, M. brunneum cepa EAMb 09/01–Su es halotolerante ya que, a pesar de crecer mejor en bajas concentraciones de NaCl, es capaz de crecer hasta con un 8% de NaCl (Figura 1F).

Diseño de prototipos formulados (OD y WP) a partir de conidios

No existe una receta universal como método de producción de esporas de hongos entomopatógenos. Cada microorganismo, e incluso cada cepa, requiere de su propio desarrollo, aunque siempre se puede tener en cuenta la metodología y componentes que se utilizan para la producción de otras cepas o incluso especies. El proceso se inicia en laboratorio, se escala en Planta Piloto y finalmente se realiza la producción a nivel industrial. Cada paso a un nivel superior requiere de ajustes para una optimización continua.

El objetivo de este proyecto es diseñar diferentes prototipos formulados a partir de una cepa del hongo entomopatógeno M. brunneum. El método más frecuente utilizado para producir conidios (esporas infectivas) de Metharizium es la fermentación sólida. Para ello se inocularon 100mL medio GYL (glucosa, extracto de levadura, hidrogenofosfato potásico y una fuente de nitrógeno) con 5·10⁶conidios/mL de M. brunneum cepa EAMb 09/01–Su procedente de cultivo sólido y se incubó a 26ºC, 200rpm durante 72 h. A continuación, se realizó un screening de diferentes sustratos sólidos con el fin de determinar cuál de ellos era el óptimo para la producción de conidios. Los sustratos evaluados fueron arroz integral, arroz vaporizado, arroz largo, arroz redondo, maíz, grano de espelta, centeno, cebada y soja texturizada. Para ello se pesaron 15 g de cada uno de ellos y se depositaron en placas de petri de vidrio de 9 cm de Ø, se esterilizaron y se inocularon con 0,1 mL de pre–inóculo/g de sustrato. Los cultivos sólidos se incubaron a 26°C hasta la producción de conidios (10–15 días). Seguidamente se secaron durante 24h y se separaron las esporas del sustrato sólido mediante tamizado (850 µm). Se envasaron en recipientes estériles y se obtuvo una muestra de peso conocido para la evaluación de la concentración mediante recuento de esporas y unidades formadoras de colonias (UFC). El sustrato óptimo finalmente seleccionado fue el arroz vaporizado.

Una vez recuperadas los conidios, éstas se utilizaron como ingrediente activo para formular diferentes prototipos (Figura 2). En total se prepararon 6 formulaciones oleosas OD (OD–D, OD–E, OD–F, OD–G, OD–H y OD–I) y 2 formulaciones en polvo mojable (WP–A y WP–B). Las matrices OD contaban con diferentes combinaciones de 5 carriers, 5 emulsionantes, 1 agente dispersante y 2 agentes reológicos, mientras que las WP se formularon a partir de diferentes combinaciones de 3 carriers, 1 agente dispersante, 1 protector UV y 2 agentes espesantes.

Selección de prototipos en base a la eficacia frente al insecto modelo Ceratitis capitata

Dado que la mosca del olivo B. oleae es una especie monófaga cuya adaptación a dietas artificiales es complicada, se utilizó como insecto modelo C. capitata, especie polífaga más fácil de criar en un sistema de dieta artificial en condiciones controladas (Fitotrón, 25+2ºC; 50–60% de HR, y 16 h luz: 8h oscuridad). A los adultos se les administró agua y dieta (40 g de hidrolizado de levadura (ICN Biomedicals, OH, USA) y 10g de sacarosa). Igualmente, las larvas se criaron hasta la fase de pupa en dieta artificial (300 g salvado de trigo, 75 g de sacarosa, 38 g de levadura, 2 g nipagin, 2 g nipasol, y 2,4 g de ácido benzoico disueltos en 600 mL de agua destilada por kg de dieta).

Se evaluaron ocho prototipos: dos en forma de polvo mojable (WP–A y WP–B) y seis en forma de dispersión oleosa (OD–D, OD–E, OD–F, OD–G, OD–H y OD–I), así como la cepa sin formular en forma de Ingrediente Activo Grado Técnico (IAGT). La dosis de los productos se fijó en el 1% independientemente de la concentración del formulado (que oscilaba entre 7,5 x 10⁶ UFCs/mL y 2.6 x 10⁷ UFCs/mL) y se evaluaron frente a larvas o pupas del tetrífido modelo C. capitata. En una segunda serie de ensayos (datos no mostrados), se probaron únicamente los productos que habían resultado más eficaces a diferentes dosis superiores o inferiores al 1% (0,25%, 0,50%, 0,75%, 1%, 1,25%, 1,50%, 1,75% y 2%).

Cada uno de los tratamientos contaba con 6 repeticiones. Por otra parte, cada repetición consistía en una caja de cristal cilíndrica (Ø10 cm x 6 cm de altura) con 20 g de suelo con 15 larvas (ensayos 1 y 2) o 20 pupas (ensayos 3 y 4) recubiertos por una malla de nylon de 250 micras a la que se aplicó (mediante aspersión con aerógrafo) un volumen de 1,5 mL de solución del prototipo a ensayar por cada 5 g de suelo (6 mL/repetición) (Figura 3). En todos los ensayos se añadió un control donde el tratamiento aplicado fue agua destilada estéril, la misma agua utilizada para preparar las soluciones de los productos a evaluar.

El suelo utilizado procedía de un campo de olivos situado en Sant Sadurní d’Anoia, Barcelona, España. Dicho suelo fue tamizado (2 mm de malla), secado durante 5 días a temperatura ambiente (aproximadamente 26ºC) y esterilizado (121ºC, 60 minutos) en dos días consecutivos antes de su uso en los diferentes ensayos.

Una vez realizadas las aplicaciones de cada prototipo, se introdujeron las cajas de cristal en cajas más grandes (59x40x25 cm) y se cubrieron con papel de filtro humedecido en cámaras climáticas (fitotrón POL–EKO, Modelo KK700 TOP; 26±2ºC, HR 65% y un fotoperiodo de 16:8 h (luz: oscuridad).

Las lecturas de emergencia de adultos se iniciaron en el momento en el que se observó el primer adulto y se prolongaron durante 4–5 días. Al final de los ensayos, las larvas que no llegaron a pupar y/o las pupas de las que no llegaron a emerger adultos, se fotografiaron y depositaron en cámaras húmedas o placas de Petri con medio de cultivo para la confirmación de la colonización por parte de la cepa EAMb 09/01–Su de M. brunneum (Figura 4).

Los resultados de los 4 ensayos se analizaron con el programa estadístico R Program. Se observó que lo datos seguían una distribución normal (test de Bartlett) y se procedió al análisis de varianza mediante el test ANOVA. Para comparar las medias de emergencia y eficacia entre los tratamientos se utilizó el test LSD (P<0,05).

Los porcentajes de emergencia presentados por los controles fue del 82,22% en el primer ensayo sobre larvas (Figura 5A) y 62,50% en el segundo (Figura 5B), mientras que en el de pupas la emergencia osciló entre el 59,63% (Figura 5C) y 66,25% (Figura 5D).

Todos los prototipos evaluados presentaron reducciones significativas de la emergencia comparados con el control y una eficacia igual o superior a la del IAGT de la cepa EAMb 09/01–Su de M. brunneum sin formular tanto sobre pupas como sobre larvas del tetrífido modelo C. capitata, a excepción del formulado OD–H sobre pupas (Figura 5).

De los ocho prototipos evaluados, los más eficaces sobre larvas fueron OD–G (93,33%), OD–H y OD–I (ambos 86,67%) y WP–B (80%), mientras que los más relevantes sobre pupas fueron WP–B (67,93%), OD–G (64,15%) y OD–I (60,38%) (Figuras 6 y 7).

Dado que el proyecto prevé ensayos de eficacia en campo con distintos tipos de formulaciones, finalmente se han seleccionado los prototipos WP–B y OD–G para evaluar en las siguientes fases del proyecto. Estos se deberán aplicar entre el 0,75 y el 1,0% (según los resultados de los ensayos de dosis no presentados en este artículo).

Conclusiones

La caracterización de las propiedades biológicas de la cepa crecida bajo diferentes condiciones ambientales, permite concluir que M. brunneum cepa EAMb 09/01–Su es un hongo ecológicamente competitivo ya que es osmotolerante, halotolerante, mesófilo, y puede crecer en un amplio rango de pH, por lo que tiene la capacidad de adaptarse a diversos tipos de suelos.

Los resultados de esta primera etapa del proyecto permiten disponer de dos prototipos de formulación (un polvo mojable y una suspensión oleosa) basados en conidios del hongo M. brunneum obtenidas por fermentación usando como sustrato arroz vaporizado, que alcanzan eficacias prometedoras sobre la mosca modelo C. capitata, sobre todo frente a larvas (80–93%) pero también sobre pupas del insecto (64–68%).

Contribución de los autores

LP–E y SM–S han contribuido en la caracterización microbiana de la cepa, VQ, MC y JML en el diseño de los prototipos bioinsecticidas, MA y CF en su evaluación de eficacia. Por otra parte, EQ–M, IG–J y MY–N cedieron la cepa EAMb 09/01–Su de M. brunneum, así como la población de C. capitata.

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